UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI PALERMO
FACOLTA' DI MEDICINA E CHIRURGIA
DIPARTIMENTO DI DISCIPLINE CHIRURGICHE ED ONCOLOGICHE

DOTTORATO DI RICERCA IN FISIOPATOLOGIA CHIRURGICA
Coordinatore  Prof. Giuseppe Modica

 

Titolo del progetto (dott.ssa A. Sunseri)

Ruolo delle proteine WISPs nella genetica del carcinoma colo-rettale


   Nelle aree geografiche caratterizzate da uno stile di vita di tipo occidentale le patologie cardiovascolari sono responsabili di circa la metà di tutti i decessi mentre le neoplasie ne causano approssimativamente un quarto. Le problematiche legate alla gestione dei pazienti oncologici coinvolgono,universalmente, sia la sanità pubblica che la politica indipendentemente dal grado di sviluppo raggiunto dalle diverse nazioni.

       Secondo le più recenti statistiche, nel 1990 sono stati diagnosticati 8100000 nuovi casi di cancro in tutto il mondo, escludendo da questo conteggio le neoplasie cutanee di origine non melanocitica; negli ultimi anni tale indice si sarebbe incrementato sino a raggiungere la quota di 10 milioni. Il carcinoma colo-rettale, in particolare, rappresenta la seconda causa di morte per tumore dopo quello del polmone nel sesso maschile e dopo quello della mammella nel sesso femminile e, mentre l’adenocarcinoma del colon presenta uguale incidenza nei due sessi, quello del retto è più frequente nel sesso maschile. I dati relativi alla sua incidenza mostrano un trend in progressiva crescita dai 500000 nuovi casi diagnosticati nel 1975 ai 783000 diagnosticati nel 1990(1).
       Anche questa, come tutte le altre patologie neoplastiche, riconosce fattori di rischio genetici ed ambientali. Quanto appena detto risulta maggiormente comprensibile alla luce dei dati relativi alla sua incidenza globale, che si attesta intorno al 9,4% nel sesso maschile e al 10,1% in quello femminile. Nei paesi occidentali (Nord-America, Australia, Nuova Zelanda ed Europa in cui è raggruppato il 63% di tutti i nuovi casi), tuttavia, tale percentuale raggiunge il 12,6% ed il 14,1% rispettivamente. Molto bassa è, invece, l’incidenza nelle aree in via di sviluppo quali quelle africane ed asiatiche(2). Queste disuguaglianze nella distribuzione geografica dei casi potrebbero trovare una spiegazione plausibile sulla base di abitudini dietetiche ed esposizioni ambientali particolari che agirebbero su individui geneticamente predisposti, in diversa misura, alla cancerogenesi. Difatti, una popolazione il cui stile di vita si discosta significativamente da quello delle altre, nel contesto di una stessa comunità, mostrerà significative differenze anche nella propria incidenza di carcinoma colo-rettale. Inoltre, alcune valutazioni condotte sui flussi migratori hanno mostrato che gli immigrati, già dalla loro prima generazione, sarebbero esposti ad un rischio di cancerogenesi identico a quello della loro nuova comunità, anche quando questo si discosti notevolmente da quello del loro paese di origine. I discendenti degli immigrati giapponesi negli Stati Uniti, ad esempio, presentano un rischio paragonabile a quello dei soggetti di razza bianca e cioè anche tre o quattro volte superiore a quello dei loro connazionali ancora residenti in Giappone. E ancora, in Israele gli ebrei europei e statunitensi sono contraddistinti da un rischio di carcinoma colo-rettale significativamente superiore rispetto a quelli di origine africana ed asiatica. Indipendentemente dalla razza, inoltre, vi sono alcune affezioni ereditarie che si accompagnano ad un aumentato rischio di carcinoma colo-rettale quali: la poliposi familiare, la sindrome di Lynch 1 e la sindrome di Lynch 2. Gli adenomi villosi, tubulari, tubulo-villosi e le malattie infiammatorie croniche, in particolare la rettocolite ulcerosa, rappresentano, a tutti gli effetti, delle lesioni preneoplastiche.
       
         In Italia ogni anni si manifestano circa 34000 nuovi casi, e ne sono affetti 77,5 abitanti ogni 100000. Stando alle proiezioni, nel 2005 la popolazione italiana sarà seconda solo a quella spagnola per il tasso di incremento annuale. I tassi di incidenza, così come quelli di mortalità, variano da regione a regione, ma innanzitutto tra nord e sud del paese. Nel quinquennio 1988-92, l’incidenza (maschi + femmine) per 100000 abitanti, nelle città provviste di un Registro Tumori validato è stata la seguente:
 - Torino: 125,1 (25 casi/anno);
 - Genova: 159,2 (31,8 casi/anno);
 - Varese: 124 (25 casi/anno);
 - Trieste: 193,5 (38,7 casi/anno);
 - Parma: 149,6 (29,9 casi/anno);
 - Firenze: 154,4 (30,8 casi/anno);
 - Latina: 67,9 (13,6 casi/anno);
 - Ragusa: 63,2 (12,6 casi/anno);

I motivi che possono spiegare queste differenze sono da ricercare, principalmente, nell’influenza del regime alimentare. E’ ormai acquisito, infatti, che una dieta ricca di cereali, fibre, verdure e povera di grassi animali esplicherebbe un’azione protettiva nei confronti di questa neoplasia. Nelle regioni del nord rispetto a quelle del sud si consumano più proteine animali e meno fibre, sebbene in questi ultimi tempi queste differenze tendano progressivamente a ridursi: l’utilizzo, espresso in grammi/die pro capite dei cereali è di 238 g rispetto ai 321 del sud; delle proteine animali di 109 rispetto ai 92; dei grassi animali di 121 rispetto ad 84 e delle fibre di 87 rispetto ai 106 g del sud. Le percentuali di mortalità per cancro del colon-retto nelle stesse città, e nello stesso quinquennio, è la seguente:
 - Torino: 68,8 (13,7 casi/anno);
 - Genova: 87,7 (17,5 casi/anno);
 - Varese: 49,1 (9,8 casi/anno);
 - Trieste: 99,9 (20 casi/anno);
 - Parma: 75,7 (15,1 casi/anno);
 - Firenze: 68,6 (13,7 casi/anno);
 - Latina: 4,9 (10 casi/anno);
 - Ragusa: 47,2 (9,4 casi/anno);

Il rapporto tra casi incidenti e tasso di mortalità indica che, mediamente, ogni anno muore circa il 55% di questi pazienti e tale percentuale, per le stesse città, risulta essere rispettivamente: 54,8%, 55,0%, 39,2%, 51,6%, 50,5%, 44,4%, 73,5%, 74,6%.

    Premesso che i Registri Tumori di Latina e Ragusa non possono da soli rappresentare l’intera realtà del centro-sud, le differenze per quanto riguarda la percentuale di mortalità vanno giustificate alla luce della carenza, relativamente al periodo in esame, sia di centri specialistici di oncologia che di servizi di radioterapia necessari per un adeguato trattamento del carcinoma del retto.

    Pur in assenza di dati certi, si ritiene che agli inizi degli anni 90,in Italia, non oltre il 35-40% dei pazienti affetti da carcinoma del colon fossero sottoposti ad una corretta chemioterapia adiuvante, mentre solo il 10-15% dei pazienti affetti da neoplasia del retto beneficiassero di una terapia adiuvante (radioterapia da sola o associata alla chemioterapia). Oggi tali percentuali sono significativamente aumentate sino al 65-70% per il colon e circa al 50% per il retto grazie ad una maggiore e più convincente messe di dati derivanti da trials clinici internazionali, ad una compliance più responsabile da parte dei pazienti stessi e ad un’aumentata disponibilità dei servizi di oncologia medica, di radioterapia e di nuovi e più efficaci farmaci per il controllo di questa neoplasia(3).

   
Inoltre un ulteriore strumento in possesso degli operatori, legato sia al miglioramento delle metodiche di diagnosi precoce che alla sperimentazione di farmaci antiblastici sempre più selettivi, è basato sulla ricerca di marcatori di degenerazione neoplastica. E’ in questa ottica che si inserisce il progetto di ricerca proposto. In particolare  alla luce delle più recenti ricerche che hanno identificato nel pathway di Wnt/
b-catenina uno di quelli più frequentemente alterati nel carcinoma colo-rettale, l’aspetto che mi ripropongo di analizzare è il  comportamento delle proteine membri della famiglia dei CCN, ed in particolare delle proteine WISPs, in relazione al loro potenziale coinvolgimento nell’acquisizione del fenotipo neoplastico da parte delle cellule differenziate dell’epitelio del colon-retto.

    Crescente importanza negli ultimi anni è stata infatti attibuita al ruolo dei “CCN” nel controllo di alcuni meccanismi molecolari coinvolti nella carcinogenesi. La famiglia dei ”CCN”, dall’acronimo dei membri originariamente descritti (Cystein rich 61-Cyr61/CCN1, Connective Tissue Growth Factor-CTGF/CCN2, Nephroblastoma Overexpressed-NOV/CCN3), comprende oggi anche altre proteine denominate WISPs (WNT-induced secreted proteins)(4). I CCN sono proteine di circa 30-40 kD, ricche in cisteina, che sembrano coinvolte nel controllo della mitosi, dell’adesione e migrazione cellulare, nella produzione di matrice extracellulare e nella crescita tumorale. Molte delle attività biologiche probabilmente derivano dal fatto che le proteine CCN hanno la capacità di legarsi ad alcune molecole della matrice extracellulare e della superficie cellulare (proteoglicani, insulin-like growth factor (IGF)-I, integrine). La caratteristica strutturale comune ai CCN è la presenza di quattro distinti moduli, che mostrano un’elevata omologia con regioni conservate appartenenti ad altre proteine extracellulari. Il modulo 1 è simile al dominio IGF-BP; il modulo 2 alle sequenze ripetute ritrovate nel von Willebrand tipo C; il modulo 3 al dominio della trombospondina tipo 1 ed il modulo 4 C terminale contiene un putativo cysteine knot (CK). La varietà nelle funzioni di queste proteine potrebbe quindi risiedere nell’eterogeneità strutturale della loroconfigurazione modulare
(4)

    Ampiamente studiato è il ruolo del CTGF/CCN2 in numerose malattie fibrotiche, come ad esempio l’aterosclerosi(5), la fibrosi polmonare(6), pancreatica(7), renale(8) e recentemente anche epatica(9)(10). Molti dei membri della famiglia CCN sembrano essere inoltre coinvolti nel controllo di alcuni dei meccanismi alla base del processo di carcinogenesi. Il loro ruolo varia nelle diverse neoplasie, ed inoltre dipende dal tipo cellulare. Dati in letteratura mostrano, ad esempio, che l’espressione del CTGF/CCN2 induce apoptosi in cellule di carcinoma mammario(11), mentre WISP1/CCN4 inibisce l’apoptosi indotta da p53(12) e da c-myc(13). Inoltre, WISP3/CCN6 si comporta da oncosoppressore nei tumori del seno(14), mentre ha un ruolo oncogenetico nel tumore del colonretto(15). Nei tumori ormono-sensibili, come il tumore della mammella e dell’utero, l’attivazione dei geni CYR61/CCN1(16), CTGF/CCN2(17), WISP2/CCN5(18) da parte degli ormoni steroidei (estrogeno e progesterone) promuove la progressione tumorale. Al contrario nel caso dei tumori del colonretto WISP2/CCN5 svolge un ruolo di oncosoppressore(15). Inoltre, l’espressione di varianti dei membri della famiglia CCN, generate per splicing alternativo degli RNA messaggeri, sembra essere associata con lo sviluppo e la progressione di alcuni tipi di tumori(19)(20).
   
     Tra i membri della famiglia CCN, le proteine WISP1/CCN4, WISP2/CCN5, WISP3/CCN6 sembrano particolarmente interessanti nell’ambito dello sviluppo delle neoplasie colorettali, dal momento che esse sono sintetizzate in seguito all’attivazione del pathway dell’oncogene Wnt.
E’ importante sottolineare che mutazioni di alcune componenti del pathway di Wnt sono presenti in circa il 90% dei tumori colorettali, con conseguente attivazione dei geni target(21).

 Obiettivi e articolazioni della ricerca
        Partendo da queste premesse, la ricerca che propongo è indirizzata allo studio del possibile ruolo svolto dalle molecole CCN nella carcinogenesi del colon, con particolare riguardo ai WISP1-2-3 (CCN4-5-6) sia delle forme normali (wild-type, WT) sia delle eventuali forme varianti.

Studi “ex vivo”
        Il progetto prevede una prima fase di studio da effettuare su resecati chirurgici e frammenti bioptici provenienti da pazienti affetti da adenomatosi multipla familiare (FAP), polipi benigni del colon, malattie infiammatorie croniche intestinali (in particolare rettocolite ulcerosa), per la definizione dei CCN, ed in particolare dei WISPs/CCN, come molecole potenzialmente coinvolte nella cancerogenesi del colon. I livelli di espressione delle proteine nei diversi campioni saranno analizzati per immunoistochimica, mentre i livelli degli mRNA verranno analizzati mediante RT-PCR. L’analisi di immunoistochimica permetterà inoltre la caratterizzazione del tipo cellulare che esprime i WISPs/CCN. 

Un secondo aspetto dello studio riguarda l’indagine su pazienti affetti da tumori del colon-retto. Anche in questo caso verrà analizzata mediante immunoistochimica l’espressione dei CCN su sezioni provenienti da pezzi chirurgici di pazienti con carcinoma del colonretto in confronto con aree di tessuto sano circostante. L’espressione verrà correlata con il grado di differenziazione, l’angiogenesi tumorale, gli indici di apoptosi etc. Anche in questo caso l’espressione delle forme WT e delle eventuali forme varianti verrà analizzata mediante RT-PCR confrontando per ogni paziente l’area tumorale con la regione circostante di tessuto non tumorale.

Più in dettaglio la ricerca sarà così effettuata:

·    Raccolta dei campioni tissutali
Il materiale chirurgico e/o bioptico raccolto durante interventi chirurgici e/o endoscopie effettuate a scopo diagnostico o terapeutico, sarà immediatamente congelato in azoto liquido e conservato a -80°C fino a quando non verrà processato.

Analisi di immunoistochimica
Le sezioni di tessuto paraffinato di 4 mm saranno sottoposte a trattamento deparaffinizzante e quindi incubate con H2O2  per abolire attività perossidasica endogena. Le sezioni saranno poi incubate con lo specifico anticorpo primario quindi con un anticorpo biotinilato anti-mouse o anti-rabbit e successivamente con un complesso avidina-biotina-perossidasi. Infine saranno poste a contatto con l’appropriato substrato e colorate con l’ematossilina. L’espressione dei WISPs sarà correlata con altri marcatori  di proliferazione cellulare, angiogenesi, apoptosi etc.

     Estrazione di RNA dai tessuti congelati
I tessuti congelati saranno omogeneizzati in presenza del reagente “Trizol” e l’RNA totale sarà estratto come da metodica già messa a punto. L’RNA totale sarà quindi utilizzato per l’analisi mediante RT-PCR semiquantitativa con specifici primers per WISP e beta-actina come controllo della qualità dell’RNA e per la normalizzazione dei prodotti di amplificazione.

Bibliografia:

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