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Nelle aree geografiche caratterizzate da uno stile di vita di tipo
occidentale le patologie cardiovascolari sono responsabili di circa
la metà di tutti i decessi mentre le neoplasie ne causano
approssimativamente un quarto. Le problematiche legate alla gestione
dei pazienti oncologici coinvolgono,universalmente, sia la sanità
pubblica che la politica indipendentemente dal grado di sviluppo
raggiunto dalle diverse nazioni.
Secondo le più recenti statistiche, nel
1990 sono stati diagnosticati 8100000 nuovi casi di cancro in tutto
il mondo, escludendo da questo conteggio le neoplasie cutanee di
origine non melanocitica; negli ultimi anni tale indice si sarebbe
incrementato sino a raggiungere la quota di 10 milioni. Il carcinoma
colo-rettale, in particolare, rappresenta la seconda causa di morte
per tumore dopo quello del polmone nel sesso maschile e dopo quello
della mammella nel sesso femminile e, mentre l’adenocarcinoma del
colon presenta uguale incidenza nei due sessi, quello del retto è
più frequente nel sesso maschile. I dati relativi alla sua incidenza
mostrano un trend in progressiva crescita dai 500000 nuovi
casi diagnosticati nel 1975 ai 783000 diagnosticati nel 1990(1).
Anche questa, come tutte le altre patologie
neoplastiche, riconosce fattori di rischio genetici ed ambientali.
Quanto appena detto risulta maggiormente comprensibile alla luce dei
dati relativi alla sua incidenza globale, che si attesta intorno al
9,4% nel sesso maschile e al 10,1% in quello femminile. Nei paesi
occidentali (Nord-America, Australia, Nuova Zelanda ed Europa in cui
è raggruppato il 63% di tutti i nuovi casi), tuttavia, tale
percentuale raggiunge il 12,6% ed il 14,1% rispettivamente. Molto
bassa è, invece, l’incidenza nelle aree in via di sviluppo quali
quelle africane ed asiatiche(2). Queste disuguaglianze
nella distribuzione geografica dei casi potrebbero trovare una
spiegazione plausibile sulla base di abitudini dietetiche ed
esposizioni ambientali particolari che agirebbero su individui
geneticamente predisposti, in diversa misura, alla cancerogenesi.
Difatti, una popolazione il cui stile di vita si discosta
significativamente da quello delle altre, nel contesto di una stessa
comunità, mostrerà significative differenze anche nella propria
incidenza di carcinoma colo-rettale. Inoltre, alcune valutazioni
condotte sui flussi migratori hanno mostrato che gli immigrati, già
dalla loro prima generazione, sarebbero esposti ad un rischio di
cancerogenesi identico a quello della loro nuova comunità, anche
quando questo si discosti notevolmente da quello del loro paese di
origine. I discendenti degli immigrati giapponesi negli Stati Uniti,
ad esempio, presentano un rischio paragonabile a quello dei soggetti
di razza bianca e cioè anche tre o quattro volte superiore a quello
dei loro connazionali ancora residenti in Giappone. E ancora, in
Israele gli ebrei europei e statunitensi sono contraddistinti da un
rischio di carcinoma colo-rettale significativamente superiore
rispetto a quelli di origine africana ed asiatica. Indipendentemente
dalla razza, inoltre, vi sono alcune affezioni ereditarie che si
accompagnano ad un aumentato rischio di carcinoma colo-rettale
quali: la poliposi familiare, la sindrome di Lynch 1 e la sindrome
di Lynch 2. Gli adenomi villosi, tubulari, tubulo-villosi e le
malattie infiammatorie croniche, in particolare la rettocolite
ulcerosa, rappresentano, a tutti gli effetti, delle lesioni
preneoplastiche.
In Italia ogni anni si
manifestano circa 34000 nuovi casi, e ne sono affetti 77,5 abitanti
ogni 100000. Stando alle proiezioni, nel 2005 la popolazione
italiana sarà seconda solo a quella spagnola per il tasso di
incremento annuale. I tassi di incidenza, così come quelli di
mortalità, variano da regione a regione, ma innanzitutto tra nord e
sud del paese. Nel quinquennio 1988-92, l’incidenza (maschi +
femmine) per 100000 abitanti, nelle città provviste di un Registro
Tumori validato è stata la seguente:
- Torino: 125,1 (25 casi/anno);
- Genova: 159,2 (31,8 casi/anno);
- Varese: 124 (25 casi/anno);
- Trieste: 193,5 (38,7 casi/anno);
- Parma: 149,6 (29,9 casi/anno);
- Firenze: 154,4 (30,8 casi/anno);
- Latina: 67,9 (13,6 casi/anno);
- Ragusa: 63,2 (12,6 casi/anno);
I motivi
che possono spiegare queste differenze sono da ricercare,
principalmente, nell’influenza del regime alimentare. E’ ormai
acquisito, infatti, che una dieta ricca di cereali, fibre, verdure e
povera di grassi animali esplicherebbe un’azione protettiva nei
confronti di questa neoplasia. Nelle regioni del nord rispetto a
quelle del sud si consumano più proteine animali e meno fibre,
sebbene in questi ultimi tempi queste differenze tendano
progressivamente a ridursi: l’utilizzo, espresso in grammi/die pro
capite dei cereali è di 238 g rispetto ai 321 del sud; delle
proteine animali di 109 rispetto ai 92; dei grassi animali di 121
rispetto ad 84 e delle fibre di 87 rispetto ai 106 g del sud. Le
percentuali di mortalità per cancro del colon-retto nelle stesse
città, e nello stesso quinquennio, è la seguente:
- Torino: 68,8 (13,7 casi/anno);
- Genova: 87,7 (17,5 casi/anno);
- Varese: 49,1 (9,8 casi/anno);
- Trieste: 99,9 (20 casi/anno);
- Parma: 75,7 (15,1 casi/anno);
- Firenze: 68,6 (13,7 casi/anno);
- Latina: 4,9 (10 casi/anno);
- Ragusa: 47,2 (9,4 casi/anno);
Il rapporto
tra casi incidenti e tasso di mortalità indica che, mediamente, ogni
anno muore circa il 55% di questi pazienti e tale percentuale, per
le stesse città, risulta essere rispettivamente: 54,8%, 55,0%,
39,2%, 51,6%, 50,5%, 44,4%, 73,5%, 74,6%.
Premesso che i Registri Tumori di Latina e Ragusa non possono
da soli rappresentare l’intera realtà del centro-sud, le differenze
per quanto riguarda la percentuale di mortalità vanno giustificate
alla luce della carenza, relativamente al periodo in esame, sia di
centri specialistici di oncologia che di servizi di radioterapia
necessari per un adeguato trattamento del carcinoma del retto.
Pur in assenza di dati certi, si ritiene che agli inizi degli
anni 90,in Italia, non oltre il 35-40% dei pazienti affetti da
carcinoma del colon fossero sottoposti ad una corretta chemioterapia
adiuvante, mentre solo il 10-15% dei pazienti affetti da neoplasia
del retto beneficiassero di una terapia adiuvante (radioterapia da
sola o associata alla chemioterapia). Oggi tali percentuali sono
significativamente aumentate sino al 65-70% per il colon e circa al
50% per il retto grazie ad una maggiore e più convincente messe di
dati derivanti da trials clinici internazionali, ad una
compliance più responsabile da parte dei pazienti stessi e ad
un’aumentata disponibilità dei servizi di oncologia medica, di
radioterapia e di nuovi e più efficaci farmaci per il controllo di
questa neoplasia(3).
Inoltre un ulteriore strumento in possesso degli
operatori, legato sia al miglioramento delle metodiche di diagnosi
precoce che alla sperimentazione di farmaci antiblastici sempre più
selettivi, è basato sulla ricerca di marcatori di degenerazione
neoplastica. E’ in questa ottica che si inserisce il progetto di
ricerca proposto. In particolare alla luce delle più recenti
ricerche che hanno identificato nel pathway di Wnt/b-catenina
uno di quelli più frequentemente alterati nel carcinoma
colo-rettale, l’aspetto che mi ripropongo di analizzare è il
comportamento delle proteine membri della famiglia dei CCN, ed in
particolare delle proteine WISPs, in relazione al loro potenziale
coinvolgimento nell’acquisizione del fenotipo neoplastico da parte
delle cellule differenziate dell’epitelio del colon-retto.
Crescente importanza negli ultimi anni è stata infatti
attibuita al ruolo dei “CCN” nel controllo di alcuni meccanismi
molecolari coinvolti nella carcinogenesi. La famiglia dei ”CCN”,
dall’acronimo dei membri originariamente descritti (Cystein
rich 61-Cyr61/CCN1, Connective Tissue Growth
Factor-CTGF/CCN2, Nephroblastoma
Overexpressed-NOV/CCN3), comprende oggi anche altre proteine
denominate WISPs (WNT-induced secreted proteins)(4). I
CCN sono proteine di circa 30-40 kD, ricche in cisteina, che
sembrano coinvolte nel controllo della mitosi, dell’adesione e
migrazione cellulare, nella produzione di matrice extracellulare e
nella crescita tumorale. Molte delle attività biologiche
probabilmente derivano dal fatto che le proteine CCN hanno la
capacità di legarsi ad alcune molecole della matrice extracellulare
e della superficie cellulare (proteoglicani, insulin-like growth
factor (IGF)-I, integrine). La caratteristica strutturale comune ai
CCN è la presenza di quattro distinti moduli, che mostrano
un’elevata omologia con regioni conservate appartenenti ad altre
proteine extracellulari. Il modulo 1 è simile al dominio IGF-BP; il
modulo 2 alle sequenze ripetute ritrovate nel von Willebrand tipo C;
il modulo 3 al dominio della trombospondina tipo 1 ed il modulo 4 C
terminale contiene un putativo cysteine knot (CK). La varietà nelle
funzioni di queste proteine potrebbe quindi risiedere
nell’eterogeneità strutturale della loroconfigurazione modulare(4)
Ampiamente studiato è il ruolo del CTGF/CCN2 in numerose
malattie fibrotiche, come ad esempio l’aterosclerosi(5),
la fibrosi polmonare(6), pancreatica(7),
renale(8) e recentemente anche epatica(9)(10).
Molti dei membri della famiglia CCN sembrano essere inoltre
coinvolti nel controllo di alcuni dei meccanismi alla base del
processo di carcinogenesi. Il loro ruolo varia nelle diverse
neoplasie, ed inoltre dipende dal tipo cellulare. Dati in
letteratura mostrano, ad esempio, che l’espressione del CTGF/CCN2
induce apoptosi in cellule di carcinoma mammario(11),
mentre WISP1/CCN4 inibisce l’apoptosi indotta da p53(12)
e da c-myc(13). Inoltre, WISP3/CCN6 si comporta da
oncosoppressore nei tumori del seno(14), mentre ha un
ruolo oncogenetico nel tumore del colonretto(15). Nei
tumori ormono-sensibili, come il tumore della mammella e dell’utero,
l’attivazione dei geni CYR61/CCN1(16), CTGF/CCN2(17),
WISP2/CCN5(18) da parte degli ormoni steroidei (estrogeno
e progesterone) promuove la progressione tumorale. Al contrario nel
caso dei tumori del colonretto WISP2/CCN5 svolge un ruolo di
oncosoppressore(15). Inoltre, l’espressione di varianti
dei membri della famiglia CCN, generate per splicing alternativo
degli RNA messaggeri, sembra essere associata con lo sviluppo e la
progressione di alcuni tipi di tumori(19)(20).
Tra i membri della famiglia CCN, le proteine
WISP1/CCN4, WISP2/CCN5, WISP3/CCN6 sembrano particolarmente
interessanti nell’ambito dello sviluppo delle neoplasie colorettali,
dal momento che esse sono sintetizzate in seguito all’attivazione
del pathway dell’oncogene Wnt.
E’ importante sottolineare che mutazioni di alcune componenti del
pathway di Wnt sono presenti in circa il 90% dei tumori colorettali,
con conseguente attivazione dei geni target(21).
Obiettivi
e articolazioni della ricerca
Partendo da queste premesse, la ricerca che propongo è indirizzata
allo studio del possibile ruolo svolto dalle molecole CCN nella
carcinogenesi del colon, con particolare riguardo ai WISP1-2-3
(CCN4-5-6) sia delle forme normali (wild-type, WT) sia delle
eventuali forme varianti.
Studi “ex vivo”
Il progetto prevede una prima fase di studio da effettuare su
resecati chirurgici e frammenti bioptici provenienti da
pazienti affetti da adenomatosi multipla familiare (FAP), polipi
benigni del colon, malattie infiammatorie croniche intestinali (in
particolare rettocolite ulcerosa), per la definizione dei
CCN, ed in particolare dei WISPs/CCN, come molecole potenzialmente
coinvolte nella cancerogenesi del colon. I livelli di espressione
delle proteine nei diversi campioni saranno analizzati per
immunoistochimica, mentre i livelli degli mRNA verranno analizzati
mediante RT-PCR. L’analisi di immunoistochimica permetterà inoltre
la caratterizzazione del tipo cellulare che esprime i WISPs/CCN.
Un secondo aspetto
dello studio riguarda l’indagine su
pazienti affetti da tumori
del colon-retto.
Anche in questo caso verrà analizzata mediante immunoistochimica
l’espressione dei CCN su sezioni provenienti da pezzi chirurgici di
pazienti con carcinoma del colonretto in confronto con aree di
tessuto sano circostante. L’espressione verrà correlata con il grado
di differenziazione, l’angiogenesi tumorale, gli indici di apoptosi
etc. Anche in questo caso l’espressione delle forme WT e delle
eventuali forme varianti verrà analizzata mediante RT-PCR
confrontando per ogni paziente l’area tumorale con la regione
circostante di tessuto non tumorale.
Più in dettaglio la ricerca sarà così effettuata:
· Raccolta
dei campioni tissutali
Il materiale chirurgico e/o bioptico
raccolto durante interventi chirurgici e/o endoscopie effettuate a
scopo diagnostico o terapeutico, sarà immediatamente congelato in
azoto liquido e conservato a -80°C fino a quando non verrà
processato.
Analisi di immunoistochimica
Le sezioni di tessuto paraffinato di 4 mm saranno
sottoposte a trattamento deparaffinizzante e quindi incubate con
H2O2 per abolire attività perossidasica endogena. Le sezioni
saranno poi incubate con lo specifico anticorpo primario quindi con
un anticorpo biotinilato anti-mouse o anti-rabbit e successivamente
con un complesso avidina-biotina-perossidasi. Infine saranno poste a
contatto con l’appropriato substrato e colorate con l’ematossilina.
L’espressione dei WISPs sarà correlata con altri marcatori di
proliferazione cellulare, angiogenesi, apoptosi etc.
Estrazione di RNA
dai tessuti congelati
I tessuti congelati saranno omogeneizzati in presenza
del reagente “Trizol” e l’RNA totale sarà estratto come da metodica
già messa a punto. L’RNA totale sarà quindi utilizzato per l’analisi
mediante RT-PCR semiquantitativa con specifici primers per WISP e
beta-actina come controllo della qualità dell’RNA e per la
normalizzazione dei prodotti di amplificazione.
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